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介绍：
Azure Cielo™ 3和Cielo™ 6 实时荧光定量PCR系统具有的灵敏度。该系统配置新型的高性能光学系统，采用16组光纤单孔扫描设计，一根光纤用于高能LED激发，另一根用于光信号检测，可16孔同时采集(图1)。特殊的激发/发射方式保证单孔扫描时仅激发一个孔，光纤传导也有效消除光散射，避免孔外区域的激发，减少背景噪声的来源，以便更灵敏的检测。
同时Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统采用“全孔检测”技术，每个孔可采集大约100,000个数据点。检测时取读数的平均值，精准测定每个孔的荧光强度。这种“全孔检测”为每个采集时间点提供了比单孔扫描系统更准确的数据，因为单孔扫描系统仅仅采集少量的数据点。
如何可靠地检测低拷贝数的靶标呢？首先要考虑引物和探针的特异性，这会直接影响qPCR检测能力的高低，其次考虑灵敏度，即当探针信号高于背景噪声时仪器检测的灵敏度。在其他的反应成分相同的情况下，更高灵敏度的仪器可以更早的检测到信号或得到更小的Cq值。为了证明Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统在低拷贝数的靶标检测中的灵敏度和重复性，进行了单拷贝靶标DNA的扩增实验。
方法：
配制20µl反应体系，利用单拷贝DNA为模板进行qPCR扩增。
分别在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统和竞争产品的系统上运行两次96孔板。使用每个仪器提供的软件收集和分析数据，以确定每个孔的Cq值。
结果与讨论：
单拷贝DNA扩增结果发现，在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统中检测到88个孔(92%)有荧光信号，竞争产品中检测到77个孔(80%)(图2A)，结果表明，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统提高了单拷贝扩增的检测概率，这也反映了其检测灵敏度更高。那么对于单拷贝DNA扩增来说，那些没有荧光信号的孔可能是靶标DNA没有进入到孔中，所以没有检测到荧光信号。
同时发现，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统测量的Cq平均值比竞争产品要早2个循环(Cq 36.39 vs 38.53)(图2A)。并且Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Cq值SD小于竞争产品的值(0.91 vs 1.16)，这进一步说明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的检测具有良好的重复性。
此外，将两者的扩增曲线进行比较，发现在竞争产品上某些扩增曲线起峰较晚，扩增曲线起峰位置不一致（图3B），Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的扩增曲线起峰位置基本一致（图3A）。这也说明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统高灵敏度的“全孔检测”技术和多数据点的捕获方式可以给您带来真实可靠的扩增结果。
总的来说，随着靶标DNA数量的减少，qPCR的可靠性也会逐渐降低，然而现代应用不断突破这一技术的极限，对qPCR的性能提出了更高的要求。以上结果证明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统具有的灵敏度和可靠性，即使检测单拷贝DNA分子，仍可获得具有高度重复性的定量数据。
参考文献：
1. Lockey C, Otto E, Long Z. Real-Time Fluorescence Detection of a Single DNA Molecule. BioTechniques. 1998; 24:744–746.
2. Stowers CC, Haselton FR, Boczko EM. An Analysis of Quantitative PCR Reliability Through Replicates Using the Ct Method. J Biomed Sci Eng. 2010;3(5):459-469.
3. Stadler J, Eder J, Pratscher B, et al. SNPase-ARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation-Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients. PLoS One. 2015;10(11):e0142273.
4. Tosiano MA, Jacobs JL, Shutt KA, et al. A Simpler and More Sensitive Single-Copy HIV-1 RNA Assay for Quantification of Persistent HIV-1 Viremia in Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. J Clin Microbiol. 2019;57(3):e01714-e01718.
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