紫外光度计测总黄酮的原理

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紫外光度计（紫外分光光度计）测总黄酮的原理基于黄酮类化合物在紫外光区的特征吸收特性，结合比尔定律（Beer-Lambert Law）实现定量分析。具体原理及步骤如下：

一、核心原理
1.特征吸收峰
黄酮类化合物的分子结构中含有共轭双键和酚羟基，使其在紫外光区（通常为250-350 nm）具有特征吸收峰。例如：
①芦丁（常见对照品）在510 nm处有强吸收；
②大豆异黄酮在259 nm处有最大吸收；
③蜂胶中的黄酮类化合物在415 nm附近有吸收。
2.显色反应（可选）
为提高灵敏度和选择性，可通过显色反应增强吸收信号。例如：
①亚硝酸钠-硝酸铝法：黄酮类化合物的3,5-二羟基与Al³⁺形成络合物，在碱性条件下（NaOH）生成橙红色产物，最大吸收波长红移至510 nm。
②三氯化铝法：适用于含3-羟基或5-羟基的黄酮，显色后在420 nm处测定。
3.比尔定律
吸光度（A）与溶液中黄酮类化合物的浓度（c）成正比，公式为：A=ε⋅b⋅c
其中：
ε 为摩尔吸光系数（常数）；
b 为光程（比色皿厚度，通常为1 cm）；
c 为溶液浓度（mg/mL）。

二、操作步骤
1.样品提取与纯化
①固体样品（如中药、保健食品）：用甲醇、乙醇或石油醚提取黄酮类成分，去除脂溶性杂质。
②液体样品：直接稀释或用60%乙醇溶解。
2.显色反应（如需）
加入显色剂（如5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、氢氧化钠），反应后生成有色络合物。
3.测定吸光度
使用紫外光度计在最大吸收波长（如510 nm、415 nm或259 nm）处测定样品溶液的吸光度。
4.标准曲线法定量
①配制系列浓度的对照品溶液（如芦丁），测定吸光度并绘制标准曲线（吸光度 vs 浓度）。
②根据样品吸光度，从标准曲线上查得总黄酮浓度，计算含量：X=C⋅V1⋅V3×100/V2⋅M×1000
其中：
X：总黄酮含量（g/100g或g/100mL）；
C：标准曲线上查得的浓度（mg/mL）；
V1：试样定容体积（mL）；
V2：吸取供试品溶液体积（mL）；
V3：对照品溶液定容体积（mL）；
M：试样取样量（g或mL）。

三、关键点
1.波长选择
根据黄酮类型和显色反应选择最大吸收波长，避免干扰峰。例如：
①芦丁显色后选510 nm；
②大豆异黄酮直接测259 nm。
2.显色条件优化
①反应时间（如亚硝酸钠反应6分钟，硝酸铝反应6分钟，总反应时间15分钟）；
②试剂用量（如5%亚硝酸钠1 mL、10%硝酸铝1 mL、氢氧化钠10 mL）。
3.线性范围与检出限：芦丁标准曲线线性范围通常为0-20 μg/mL，检出限可达0.162 μg/mL。

四、应用实例
1.蜂胶总黄酮测定：
以芦丁为对照品，显色后于415 nm处测定，线性回归方程 R2=0.9999，回收率102.4%。
2.大豆异黄酮测定：直接用95%乙醇溶解，259 nm处测定，无需显色反应。

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