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分光光度计是实验室中用于定量分析物质浓度的核心仪器，通过测量物质对特定波长光的吸收程度（吸光度），结合朗伯-比尔定律（A=ε⋅c⋅l），可间接计算目标物质的浓度。以下是其使用流程、关键步骤及注意事项的详细说明：
一、使用前准备- 仪器检查
- 开机预热：开启电源后，仪器需预热15-30分钟（紫外可见分光光度计需预热更久），确保光源稳定。
- 光源检查：确认钨灯（可见光区）或氘灯（紫外光区）正常点亮，无闪烁或异常噪音。
- 波长校准：使用钬玻璃、汞灯等标准物质验证波长准确性（如546.07 nm、486.13 nm等特征峰）。
- 试剂与样品准备
- 空白对照：使用与样品相同的溶剂（如去离子水、缓冲液）作为参比溶液，消除溶剂背景吸收。
- 样品处理：确保样品澄清透明，避免悬浮颗粒干扰（如需离心或过滤）。
- 浓度范围：根据预估浓度稀释样品，使吸光度落在0.2-0.8（线性范围）之间。
二、操作步骤- 波长设置
- 根据目标物质的吸收峰选择波长（如核酸在260 nm，蛋白质在280 nm）。
- 示例：测定DNA浓度时，设置波长为260 nm。
- 调零（基线校正）
- 将空白对照溶液倒入比色皿（光程通常为1 cm），放入样品室。
- 调节“调零”或“Abs 0”旋钮，使仪器显示吸光度为0.000。
- 样品测量
- 倒出空白溶液，用待测样品润洗比色皿2-3次，再注入样品。
- 擦拭比色皿外壁水渍，放入样品室，关闭舱门。
- 读取吸光度值（A）或透光率（T，T=10−A）。
- 数据处理
- 单波长法：直接使用吸光度值计算浓度（c=A/(ε⋅l)）。
- 双波长法：选择两个波长（如260 nm和280 nm），通过差值消除杂质干扰。
- 标准曲线法：测定一系列已知浓度标准品的吸光度，绘制线性回归方程，再计算未知样品浓度。
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发表于 2025-5-28 08:58:31
