|
一、分辨率的物理基础：瑞利判据 光学显微镜的分辨率遵循瑞利判据（Rayleigh Criterion），其数学表达式为： d=n⋅sinθ0.61λ
其中： - d：最小可分辨距离（分辨率）；
- λ：照明光波长（单位：纳米，nm）；
- n：物镜与样品间介质的折射率（空气为1，油浸物镜为1.515）；
- θ：物镜对样品张角的半角（数值孔径 NA=n⋅sinθ）。
关键结论：
分辨率与波长成正比，与数值孔径成反比。缩短波长或增大数值孔径可提高分辨率。 二、影响分辨率的核心因素- 数值孔径（NA）
- 定义：数值孔径是物镜收集光线能力的量化指标，NA=n⋅sinθ。
- 优化方法：
- 使用高折射率介质（如香柏油，n=1.515）替代空气，可显著提升NA；
- 选择大孔径物镜（如油镜，NA可达1.4-1.5）。
- 极限：受物镜光学设计和制造工艺限制，NA通常不超过1.5。
- 照明光波长（λ）
- 可见光范围：400-700 nm，短波长（如蓝光，450 nm）可提高分辨率。
- 特殊光源：
- 紫外光（<400 nm）可进一步提升分辨率，但需特殊光学材料和样品兼容性；
- 荧光显微镜中，激发光波长通常短于发射光，可优化信号对比度。
- 像差校正
- 球差：光线通过球面透镜时聚焦点不一致，导致图像模糊。
- 色差：不同波长光线折射率不同，导致颜色分散。
- 解决方案：采用消色差或复消色差物镜，通过特殊玻璃组合校正色差。
- 场曲：图像边缘与中心不在同一焦平面，导致边缘模糊。
- 解决方案：使用平场物镜（Plan Apochromat）校正场曲。
三、分辨率的极限与突破- 理论极限：阿贝衍射极限
- 根据阿贝理论，光学显微镜的分辨率极限约为光波长的一半（λ/2）。
- 对于可见光（550 nm），理论分辨率极限约为220 nm。
- 突破衍射极限的技术
- 超分辨显微技术：
- 受激发射损耗显微术（STED）：通过抑制荧光分子发光范围，实现20-80 nm分辨率；
- 光激活定位显微术（PALM/STORM）：通过单分子定位，达到10-20 nm分辨率；
- 结构光照明显微术（SIM）：通过频域调制，将分辨率提升至约100 nm。
- 近场光学显微术：
- 利用探针与样品表面的近场相互作用，突破衍射极限，实现纳米级分辨率（如扫描近场光学显微镜，SNOM）。
| 
发表于 2025-7-1 08:25:09
