固相多肽合成仪操作步骤及其基本原理
固相多肽合成仪操作步骤及基本原理一、基本原理
1.固相多肽合成（SPPS）通过逐步连接氨基酸残基构建多肽链，其核心原理包括：
固相载体固定：
羧基端（C端）氨基酸通过共价键（如酯键）固定在树脂等不溶性载体上，形成反应锚点。
树脂选择需考虑化学稳定性及后续切割条件（如TFA或HF裂解）。
2.保护基团策略：
α-氨基保护：常用Fmoc（碱性脱除）或Boc（酸性脱除）基团，防止氨基自反应。
侧链保护：根据氨基酸特性选择保护基（如Trt保护半胱氨酸的巯基），避免副反应。
3.脱保护-活化-偶联循环：
脱保护：去除当前氨基酸的α-氨基保护基，暴露活性氨基（如用哌啶脱Fmoc，TFA脱Boc）。
活化：下一个氨基酸的羧基通过缩合剂（如HBTU/HOBt或DCC/DMAP）活化，形成反应性中间体。
偶联：活化氨基酸与固相载体上的氨基缩合，形成肽键，延长肽链。
4.切割与纯化：
切割：用强酸（如TFA）裂解肽链与树脂的连接键，同时脱除侧链保护基。
纯化：通过HPLC、离子交换色谱等方法去除杂质，获得目标多肽。
优势：固相载体便于分离液相杂质，减少中间纯化步骤，提高合成效率。
二、操作步骤（以全自动合成仪为例）
1.设备准备与校准
安装调试：由专业人员安装设备，检查溶剂储液瓶、气体管道连接，确认仪器各部分完好。
压力校准：
压缩空气（AIR）压力：60-100 psi
氮气（N₂）压力：5-10 psi
系统测试：包括泵、阀、检测器、温度控制、反应器搅拌等，确保运行正常。
2.反应容器与试剂准备
反应容器选择：根据合成规模（如0.1-16 mmol）选择合适树脂柱，确保材料不与反应物反应。
树脂处理：
用二氯甲烷（DCM）溶胀树脂，抽干。
用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，去除杂质，抽干备用。
试剂配制：
称量氨基酸、活化试剂（如HBTU）、溶剂（DMF、DCM）等，确保新鲜纯净。
将试剂装入贴有标签的储液瓶，按顺序放入合成仪。
3.合成程序设置与启动
参数设定：
温度：根据试剂稳定性设定（如室温至70℃）。
反应时间：脱保护、偶联步骤时间需优化（通常数分钟至数小时）。
溶剂流量：通过电磁阀校准，确保精确控制。
序列输入：在合成仪软件中输入目标多肽的氨基酸序列（从C端到N端）。
启动合成：运行预设程序，仪器自动执行以下步骤：
脱保护：加入脱保护试剂（如20%哌啶/DMF）脱除Fmoc基团，洗涤去除副产物。
偶联：将活化氨基酸溶液投入反应器，搅拌进行缩合反应。
洗涤：用DMF、DCM等洗涤树脂，清除未反应物质。
循环重复：直至完成所有氨基酸连接。
4.切割与纯化
切割：
配制裂解液（如TFA/水/三异丙基硅烷（TIPS）=95:2.5:2.5），预冷至0℃。
将肽树脂加入反应釜，加入裂解液，搅拌反应2小时。
抽滤去除树脂，用TFA洗涤树脂，合并滤液。
浓缩与沉淀：
旋转蒸发浓缩滤液至小体积。
加入冷甲基叔丁基醚（MTBE）沉淀多肽，离心收集粗肽。
纯化：
使用HPLC（如C18柱）分离目标多肽，流动相为乙腈/水（含0.1% TFA）。
收集目标峰，冻干获得纯品。
5.质量控制与记录
检测方法：
紫外检测：监控脱保护和偶联步骤的吸光度变化。
质谱分析：确认分子量及纯度。
记录参数：详细记录试剂用量、反应时间、温度、压力等，生成实验报告。
三、关键注意事项
1.试剂纯度：使用高纯度试剂（如HPLC级）避免杂质引入。
2.反应监控：通过UV检测或质谱实时监控反应进程，及时调整参数。
3.设备维护：定期清洗管路、更换密封圈，防止交叉污染。
4.安全操作：裂解液含强酸，需在通风橱中操作，佩戴防护装备。
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